Pozytywna pętla sprzężenia zwrotnego FGFR3 / FOXN1 leży u podłoża łagodnego rogowacenia skóry w porównaniu z powstawaniem raka płaskokomórkowego u ludzi czesc 4

Ludzkie keratynocyty traktowano jak w C i D, a następnie immunoblot dla ufosforylowanego (p) i całkowitego (t) c-Jun i ERK1 / 2. Wszystkie słupki błędu oznaczają SEM. Kluczowy członek rodziny AP-1 i mediator wpływu EGFR / ERK na ekspresję genów, funkcje c-Jun jako induktora lub represora transkrypcji, w zależności od genów docelowych (46). Zaobserwowaliśmy indukcję endogennej ekspresji FOXN1 podobnej do tej wywołanej przez supresję EGFR po wywołanym przez siRNA knockdown c-Jun, a także c-Fos, który działa w połączeniu z c-Jun (47); jednakże zaobserwowano niewielki lub żaden efekt po knockdown innych członków rodziny AP-1, lub Ełk-1, czynnik transkrypcyjny aktywowany przez aktywację EGFR, chociaż mechanizm niezależny od AP-1 (3 (Figura 4F i odn. 48). Ludzki region promotorowy FOXN1 zawiera przypuszczalne miejsce wiązania c-Jun w pozycjach. 2,8 kb z miejsca inicjacji transkrypcji, do którego, według eksperymentów immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), wiązało się endogenne c-Jun (Figura 4G). Aktywność transkrypcyjna promotora FOXN1 została znacznie zmniejszona przez nadekspresję c-Jun, podczas gdy była ona zwiększona w komórkach transfekowanych wektorem ekspresyjnym FGFR3 typu dzikiego i w większym stopniu wektora dla FGFR3 niosącego mutację aktywującą G380R występującą w SKs ( Ryc. 4, H i I, i odn. 20). Równolegle do tych wyników, poziomy fosfo-c-Jun jak również aktywowanego fosfo-Erk1 były zwiększone w ludzkich keratynocytach przez traktowanie EGF i zmniejszane przez FGF9 (Figura 4J). Połączenie krzyżowe FGFR3-FOXN1 w kontroli różnicowania keratynocytów. FOXN1 był wcześniej zaangażowany w dodatnią kontrolę różnicowania keratynocytów (32, 34, 49). Równolegle z ekspresją FOXN1, analiza RT-PCR w czasie rzeczywistym wykazała, że aktywacja FGFR3 przez traktowanie ludzkich keratynocytów FGF9 powodowała indukcję markerów różnicowania, takich jak keratyna i mimucyna, które były tłumione przez traktowanie EGF. Jednoczesne leczenie FGF9 i EGF wykazało, że, podobnie jak w przypadku ekspresji FOXN1, aktywacja FGFR3 odgrywała dominującą rolę w indukowaniu różnicowania przez supresję EGFR (Figura 5, A (C). Co ważne, indukcja ekspresji markera różnicowania przez traktowanie FGF9 została znacznie zmniejszona przez knockdown FOXN1, co wskazuje, że czynność różnicowania funkcji aktywacji FGFR3 jest związana z indukcją FOXN1 (Figura 5, D. F). Figura 5 Aktywacja FGFR3 indukuje różnicowanie keratynocytów poprzez mechanizm zależny od FOXN1. (A i B) Ludzkie keratynocyty traktowano ng / ml EGF lub 5 ng / ml FGF9 osobno lub w połączeniu przez 24 godziny, a następnie w czasie rzeczywistym metodą RT-PCR analizy keratyny1 (A) i mimucyny (B). (C) Ludzkie keratynocyty traktowane jak w A i B analizowano pod kątem ekspresji w mimulinie przez immunoblotting z a-tubuliną jako równą kontrolą obciążenia. (D) Ludzkie keratynocyty transfekowano siRNA anty-FOXN1 lub zaszyfrowaną kontrolą siRNA, a następnie 48 godzin później za pomocą analizy RT-PCR w czasie rzeczywistym, aby zweryfikować skuteczność knockdown genu. (E) Keratynocyty transfekowane siRNA anty-FOXN1 lub wymieszana kontrola siRNA, jak w D, pozostawiono nietraktowane lub traktowano 5 ng / ml FGF9 przez ostatnie 24 godziny doświadczenia. Poziom ekspresji keratyny i mimucryny określono metodą RT-PCR w czasie rzeczywistym. (F) Pierwotne ludzkie keratynocyty transfekowane siRNA FOXN1 pozostawiono nietraktowane lub traktowano FGF9 jak w E, a następnie analizą immunoblotową ekspresji mimuliny z a-tubuliną jako równą kontrolą obciążenia. Wyniki określono ilościowo przez densytometryczne skanowanie immunoblot i normalizację dla a-tubuliny. Wszystkie słupki błędu oznaczają SEM. Podobnie jak w przypadku skórnego SCC od pacjentów, ekspresja FOXN1 była prawie niewykrywalna w liniach komórek SCC pochodzących z keratynocytów (Suplementowa Figura 2). Zakażenie tych komórek wektorem retrowirusowym eksprymującym białko FOXN1 poddanym fuzji z domeną receptora estrogenu (ER) (34) spowodowało poziomy ekspresji białka fuzyjnego porównywalne z poziomami endogennego FOXN1 w prawidłowych ludzkich keratynocytach (Figura 6A). Aktywacja FOXN1-ER przez traktowanie 4-hydroksytamoksyfenem (4-OHT) była wystarczająca do indukowania markerów różnicowania, jak również ekspresji FGFR3 (Figura 6, B. E), potwierdzając istnienie pozytywnej przenikania między FOXN1 i FGFR3 w kontroli. różnicowania keratynocytów. Podobnie, transdukcja komórek SCCO28 za pomocą konstruktu adenowirusowego FOXN1 dała pozytywną regulację FGFR3 i markera różnicowania keratyny (Figura 6E). Figura 6 Zwiększona ekspresja FOXN1 w komórkach SCC indukuje ekspresję FGFR3 i promuje różnicowanie
[hasła pokrewne: miód nawłociowy właściwości lecznicze, dieta wątrobowa lekkostrawna, kolonoskopia przygotowanie do badania ]
[więcej w: niedoczynność tarczycy objawy skórne, sok z czarnego bzu przepis, zapalenie migdałków jak leczyć ]