Pozytywna pętla sprzężenia zwrotnego FGFR3 / FOXN1 leży u podłoża łagodnego rogowacenia skóry w porównaniu z powstawaniem raka płaskokomórkowego u ludzi ad 7

Nasze odkrycia ustanawiają FOXN1 jako induktora tego genu, który jest podobny do wzmacniającego wpływu na różnicowanie. Powstała pętla pozytywnego sprzężenia zwrotnego. w którym aktywujące mutacje FGFR3 indukują ekspresję FOXN1, co z kolei prowadzi do podwyższonej ekspresji FGFR3. może zapewnić, że dotknięte keratynocyty są zablokowane w trybie prodifferentiation, który zapobiega ich złośliwemu progresji. Wskazuje to na możliwie ogólne podejście do powstrzymywania złośliwych guzów poprzez zmianę ich wzorca ekspresji genów w kierunku obserwowanego w odpowiadających łagodnych zmianach. Metody: Analiza mikromacierzy, ilościowy RT w czasie rzeczywistym RT, testy aktywności promotora, ChIP i techniki immunodetekcji. Warunki dla analizy mikromacierzy, analizy RT-PCR w czasie rzeczywistym, ChIP, analizy typu Western blot, immunofluorescencji i aktywności promotora były takie, jak opisano wcześniej (9). W skrócie, w przypadku mikromacierzy, 15 .g całkowitego RNA z prawidłowego naskórka oraz uszkodzeń SK i SCC (wszystkie od różnych pacjentów) wykorzystano do przygotowania sondy RNA i hybrydyzacji z chipami genów (macierz U133A 2.0 genomu ludzkiego, Affymetrix) według producenta. S zalecenia. Listę swoistych dla genu starterów podano w Tabeli dodatkowej 3. W przypadku testów aktywności promotora, fragment 4,5-kbp zawierający region ekson 1b (promotor) mysiego genu FOXN1 (55) sklonowano do wektora pT7blue, a cDNA lucyferazy. z pGL3.2 (Promega) wprowadzono następnie do unikalnego miejsca BstEII zlokalizowanego około 2 900 bp od górnego końca klonowanego fragmentu genomowego i około 300 bp poniżej miejsca rozpoczęcia transkrypcji. Konstrukty FGFR3 były prezentem D. Ornitza (Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri, USA, ref. 20). Zastosowaliśmy następujące przeciwciała: FOXN1 (Santa Cruz Biotechnology Inc. G-20), keratynę1 (Babco AF87), inhucrin (Babco PRB140C), FGFR3 (Santa Cruz Biotechnology Inc. C-15), c-Jun (Transduction Labs), c-Jun dla ChIP (Santa Cruz Biotechnology Inc.), całkowite i fosfo ERK (Cell Signaling), pan-Keratyna (AbCam), Vimentin (DakoCytomation V9) i a-tubulina (Sigma-Aldrich GTU87). Obrazy fluorescencyjne uzyskano za pomocą mikroskopu skaningowego meta-laser Zeiss LSM510 (Carl Zeiss MicroImaging) stosując takie same warunki ekspozycji i rejestracji obrazu, ze stosami z 6. 8 płaszczyzn (1 mm każdy). Hodowla komórek i wirusy. Hodowanie pierwotnych ludzkich keratynocytów, komórek SCC13 i komórek SCCO28. jak również zakażenie pBabepuro FOXN1-ER (dostarczone przez D. Prowse, Cancer Research UK, Londyn, Wielka Brytania, nr ref. 34), H-rasV12 (LZRS-rasV12, odnośnik 56) i kontrolne retrowirusy; lentiwirusy dla shRNA FOXN1; i adenowirusy dla FOXN1 (41). jak podano wcześniej (9). Dwa indywidualne konstrukty shRNA w wektorze pLKO.1 (TRCN0000013193 i TRCN0000013195; Open Biosystems) dla FOXN1 zastosowano do przygotowania lentiwirusów. Komórki SCC krótko wybrano do badania oporności na puromycynę. W doświadczeniach knockdown komórki transfekowano jak opisano wcześniej (57) za pomocą siRNA dla ludzkiego EGFR i c-Jun (Invitrogen), FGFR3 i FOXN1 (Santa Cruz Biotechnology Inc.), ERK1, ERK2, JNK1, JNK2, c-Jun, JunB. , JunD, c-Fos, FosB, Fra1, Fra2 i Elk1 (Gene Globe, Qiagen) równolegle z odpowiednimi kontrolami siRNA i analizowano 48. 72 godziny po transfekcji. Inhibitor EGFR AG1478 (LC Labs) i inhibitor FGFR SU5402 (Calbiochem) rozpuszczono w DMSO i stosowano odpowiednio w stężeniach 2 i 10 .m; i rekombinowany EGF i FGF9 zakupiono od R & D Systems i stosowano odpowiednio w stężeniach 1,0 i 5,0 ng / ml. SK, SCC i normalne próbki skóry. Ludzkie próbki SK i SCC uzyskano z zatwierdzeniem przez MGH Institutional Review Board, jako materiał odrzucony podczas chirurgii mikrograficznej Mohsa. W normalnych kontrolach naskórka skóra normalna została bardzo powierzchownie ogolona no. 15 ostrzy skalpela o minimalnym kontakcie ze skórą. Alternatywnie, próbki SCC i otaczającego normalnego naskórka zamrożono w OCT i użyto do laserowej mikrodysukcji przechwytywania za pomocą automatycznego układu do mikrodysukcji laserowej AutoPix, a następnie rundę liniowej amplifikacji RNA, jak opisano wcześniej (58). Kultury narządów. Zużyte próbki skóry ludzkiej z zabiegów abdominoplastycznych uzyskano od W. Austen (MGH, Boston, Massachusetts, USA) u pacjentów. zgoda i zatwierdzenie instytucjonalne. Próbki skóry, sterylizowane w 70% etanolu i cięte. po usunięciu tłuszczu podskórnego. do kawałków x cm umieszczono w pożywce pozbawionej surowicy keratynocytowej (Gibco; Invitrogen) uzupełnionej EGF i ekstraktem przysadki bydlęcej (BPE), w 0,25% agarze (Sigma-Aldrich)
[więcej w: przychodnia jabłonna, zapalenie migdałków jak leczyć, powiększanie biustu tłuszczem ]
[więcej w: chipsy ziemniaczane z piekarnika, szczoteczka soniczna oral b, przychodnia jabłonna ]