Porównanie ludzkich sekretawek trzustki przez selekcję aptamerów in vitro identyfikuje cyklofilinę B jako kandydata na marker raka trzustki ad

Opisano różne modyfikacje nukleotydów, aby zwiększyć stabilność i powinowactwo aptameru. W szczególności, SomaLogic Inc. wykazał możliwość równoczesnej analizy setek białek krwi przy użyciu multipleksowanych zmodyfikowanych testów aptamerowych (15, 17). Te aptamery. jak większość aptamerów opracowanych do tej pory. wytworzono wobec racjonalnie wybranych oczyszczonych białek. Jest to zatem potężne podejście do wykrywania i zatwierdzania potencjalnych biomarkerów, ale nie do odkrywania nowych biomarkerów. Zamiast stosować SELEX do poszczególnych cząsteczek, zastosowaliśmy go do sekretomu raka trzustki. Opracowaliśmy in vitro – pozytywny / negatywny. Strategia SELEX do identyfikacji wydzielonych biomarkerów raka trzustki (Ryc. 1). Ta metoda. Ślepy. selekcja pozwala aptamerowi wybrać cele. Do selekcji pozytywnej zastosowano kondycjonowane pożywki reprezentujące sekretom ludzkiej linii komórkowej gruczolakoraka trzustkowego MiaPaCa-2 (ATCC). Kondycjonowane pożywki zebrane z unieśmiertelnionej, nienowotworowej linii komórek ludzkiego nabłonka trzustkowego HPDE-E6E7 (dar Ming-Sound Tsao, University Health Network, Toronto, Ontario, Kanada) (18, 19) zastosowano do selekcji negatywnej. Selekcja pozytywna / negatywna została przeprowadzona w celu wyselekcjonowania aptamerów przeciwko cząsteczkom, które są wydzielane przez komórki rakowe, ale nie przez prawidłowe komórki. Zaletą tej techniki jest jej wyjątkowa zdolność do jednoczesnego identyfikowania nowych biomarkerów i opracowywania odczynników do wykrywania ich w płynach ustrojowych. Rysunek Schemat strategii SELEX pozytywnego / negatywnego sekretu. Utworzono bibliotekę RNA z losowym regionem 40-nukleotydów (więcej niż 1014 potencjalnych sekwencji) i zmodyfikowaną 2 (3-fluoropirymidynami (2fluoro) pod względem oporności na nukleazę. W celu selekcji negatywnej bibliotekę RNA inkubowano z sekretem HPDE, a związane RNA usunięto przy użyciu błon nitrocelulozowych, które zachowały kompleksy RNA-białko. Negatywnie wybrane niezwiązane RNA inkubowano następnie z sekretiem MiaPaCa-2. W celu selekcji pozytywnej, związane RNA rozdzielono w podobny sposób od niezwiązanych RNA i użyto do wygenerowania puli RNA wzbogaconych o sekwencje wiążące się z sekretomem MiaPaCa-2. Wyniki Pozytywny / negatywny wybór powinowactwa do identyfikacji biomarkerów specyficznych dla raka trzustki. Linie komórkowe MiaPaCa-2 i HPDE6-E6E7 początkowo hodowano w odpowiednich pożywkach do prawie konfluencji, przemywano, a następnie inkubowano przez 16 godzin w pożywce bez surowicy (SFM). SFM wybrano, ponieważ obfite białka surowicy mogą maskować stosunkowo rzadkie białka wydzielane przez linie komórkowe. Kondycjonowane pożywki (CM) zawierające białka wydzielane przez rakowe i nienowotworowe linie komórkowe zebrano i przesączono w celu usunięcia resztek komórkowych, aby upewnić się, że selekcja została skupiona na wydzielanych, a nie komórkowych cząsteczkach. Następnie CM zatężono przy użyciu wirówkowych kolumn wirówkowych i dializowano wobec buforu solnego o pH i składzie elektrolitu podobnym do składu surowicy. Wytworzone sekrety zastosowano do dodatniego / ujemnego SELEX in vitro stosując bibliotekę RNA zmodyfikowaną za pomocą 2a-fluoropirymidyn pod kątem oporności na nukleazę (Figura 1). Standardowe testy wiązania oparte na filtrach radioaktywnych wykorzystano do monitorowania postępu selekcji poprzez pomiar wiązania puli RNA z sekretami (Figura 2A). Po 9 rundach selekcji pozytywnej / negatywnej pula RNA wykazała wyższe wiązanie obu sekre- tomów w porównaniu z wyjściową biblioteką RNA, ale relatywnie wyższe wiązanie z sekretomem MiaPaCa-2 w porównaniu z sekretem HPDE. Pula RNA z dziewiątej rundy została sklonowana i zsekwencjonowana. Trzy dominujące sekwencje zostały wykryte po analizie klonów i zostały oznaczone jako M9-4, M9-5 i M9-6 (Tabela 1). Poszczególne klony testowano pod kątem wiązania z sekretami MiaPaCa-2 i HPDE. Jeden z otrzymanych aptamerów (M9-5) wykazał wyższe wiązanie z sekretiem MiaPaCa-2 w porównaniu z sekretem HPDE (Figura 2B). Zgodnie z oczekiwaniami, M9-5 wykazało większe powinowactwo wiązania do sekretomu MiaPaCa-2 w oparciu o przesunięcie w lewo krzywej wiązania względem puli rundy 9. Trudno jest oszacować powinowactwo wiązania (Kd) w tych bezpośrednich testach wiązania, ponieważ wiązanie nie osiąga prawdziwego maksimum asymptotycznego i ponieważ stężenie określonego białka docelowego w obrębie sekretomu jest nieznane. W związku z tym oszacowaliśmy powinowactwo wiązania za pomocą testu wiązania konkurencyjnego. M9-5 wykazał IC50 1,5. 0,02 nM (dodatkowa postać 1, materiał dodatkowy dostępny online z tym artykułem; doi: 10,1172 / JCI62385DS1), powinowactwo odpowiednie do wykrywania nie-obfitych białek surowicy. Rysunek 2Sekretom SELEX wygenerował aptamer, M9-5, który wykazał wysokie powinowactwo wiązania do sekretomu MiaPaCa-2
[przypisy: pierwsze posiłki niemowlaka, gops jabłonna, chipsy ziemniaczane z piekarnika ]
[więcej w: dieta wątrobowa lekkostrawna, królik miniaturka baranek, jarhead żołnierz piechoty morskiej cda ]