Porównanie ludzkich sekretawek trzustki przez selekcję aptamerów in vitro identyfikuje cyklofilinę B jako kandydata na marker raka trzustki ad 6

Niedoskonała korelacja pomiędzy wiązaniem M9-5 i poziomami CypB za pomocą ELISA sugeruje, że aptamer i przeciwciało mogą nie wiązać dokładnie tych samych epitopów, a testy mogą różnić się zdolnością do rozróżniania między rakiem a łagodnymi chorobami trzustki. Aptamer może być cennym narzędziem do oczyszczania CypB i powiązanych białek w celu zbadania, czy istnieją różnice między CypB wydzielanymi przez komórki rakowe i nierakowe. Tymczasem test wiązania promieniotwórczego aptameru stosowany w tym badaniu z koncepcją proof-of-concept jest dość prosty, ale nie jest praktyczny w przypadku zastosowań klinicznych na dużą skalę. Ponadto maksymalne FB zmierzone w tym teście nie ma liniowej zależności ze stężeniem białka i dlatego może nie być idealnym sposobem do ilościowego oznaczania poziomów CypB w płynach ustrojowych. Na szczęście względna łatwość, z jaką aptamery można modyfikować chemicznie, doprowadziła do opracowania szeregu testów wykrywania opartych na aptamerach, w tym testów czujników powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR), które zostały wykorzystane do wykrywania pikomolarnych stężeń biomarkerów białkowych. (40). Jako tylko jedną możliwą alternatywę, biotynylowany aptamer M9-5 można immobilizować na chipach SPR powleczonych streptawidyną, podejście, które sprzyja wysokoprzepustowej analizie próbek klinicznych, a także potencjalnie do analizy multipleksowej z kilkoma biomarkerami aptameru. Tradycyjne podejście proteomiczne do identyfikacji biomarkerów wykorzystuje ilościowe różnice w poziomach ekspresji między nowotworowymi i nienowotworowymi proteomami (6. 8). Takie podejścia generują duże zbiory danych, które wymagają późniejszych podejść opartych na bioinformatyce w celu identyfikacji i ustalenia priorytetów dla potencjalnych biomarkerów. SELEX zasadniczo bada złożoną mieszaninę białek ze złożoną biblioteką kształtów oligonukleotydów i ma potencjał do wykrywania zarówno ilościowych, jak i jakościowych różnic pomiędzy nowotworowymi i nierakowymi proteomami. W przeciwieństwie do większości technik spektrometrii masowej, nasze podejście. który opiera się na rozpoznawaniu molekularnym. może w zasadzie zidentyfikować biomarkery, które mogą zostać pominięte przez standardowe metody profilowania ekspresji i dawać aptamery przeciw kompleksom białkowym swoistym dla raka, naprzemiennie fałdowanym białkom lub potranslacyjnymi modyfikacjami. Krytyczne dla tego stwierdzenia jest to, że nasze podejście nie zależy od precyzyjnej identyfikacji celu, ponieważ wytworzone aptamery można stosować same jako odczynniki do wykrywania, o właściwościach chemicznych, które mogą oferować przewagę techniczną nad przeciwciałami. Chociaż zastosowaliśmy tę technikę do identyfikacji wydzielanych biomarkerów raka trzustki, można ją zastosować do dowolnego innego nowotworu lub choroby, dla której istnieją odpowiednie proteomy do selekcji pozytywnej / negatywnej. Dlatego też sekrecja SELEX jest praktycznym i generalizowalnym podejściem, które może uzupełniać oparte na bioinformatyce podejście proteomiczne do odkrywania biomarkerów. Metody Przygotowanie sekretu. Komórki MiaPaCa-2 (ATCC) i HPDE-E6E7 (dar Ming-Sound Tsao, University Health Network, Toronto, Ontario, Kanada) (18, 19) hodowano w swoich mediach do bliskiego konfluencji, a następnie płukano w odpowiednich SFM i inkubowano w SFM przez 16 godzin. CM zebrano i odwirowano przy 1000 g, 4 ° C, a następnie przesączono stosując 0,2-.m sterylny system filtracyjny (Nalgene) w celu usunięcia pływających komórek i szczątków komórkowych. Następnie CM zatężono w 4 ° C stosując wirowe kolumny wirowe (VIVA SPIN 20, 3000 odcięcia masy cząsteczkowej [MWCO], Sartorius Stedium). Stężone CM dializowano wobec buforu F (20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2 i 3 mM MgCl2) przez noc w 4 ° C stosując kasety dializacyjne (3500 MWCO, Thermo Scientific). Całkowite stężenie białka w sekrecie określono za pomocą odczynnika do oznaczania białka (Bio-Rad). Próbki stężonego CM (sekretomu) przechowywano w temperaturze <80 ° C dla kolejnych testów. Secretome SELEX. Pozytywna / negatywna selekcja przeciwko sekretomowi została przeprowadzona przy użyciu protokołów SELEX, jak opisano wcześniej (41) z modyfikacjami. Specyficzne sekwencje oligonukleotydów DNA są opisane w Suplemental Methods. W skrócie, dla każdej rundy selekcji negatywnej, 2 nM RNA inkubowano z 50 ul (1,7 ug / pi)) sekretomu HPDE w buforze F. Końcowa objętość mieszaniny reakcyjnej wynosiła 200 ul i była inkubowana w 37 ° C przez 15 minut. minuty. Kompleksy białko-RNA rozdzielono od niezwiązanych mieszanin reakcyjnych z pulą RNA, stosując membrany nitrocelulozowe o średnicy 25 mm, 0,45 .m (Whatman). Negatywnie wybraną, niezwiązaną pulę RNA inkubowano następnie z 100 ul (0,2 ug / yl) MiaPaCa-2 z sekretem w buforze F w 37 ° C przez 15 minut [przypisy: oszczędzanie dla dziecka, powiększanie biustu tłuszczem, przepuklina brzuszna pooperacyjna ] [więcej w: powiększanie biustu tłuszczem, chipsy ziemniaczane z piekarnika, szczoteczka soniczna oral b ]