Niezależna od dopełniacza indukowana przez Ab indukcja płytek krwi przez nadtlenek wymaga 12-lipooksygenazy i szlaku oksydazy płytkowej NADPH cd

Fragmentację płytek monitorowano za pomocą cytometrii przepływowej płytek krwi znakowanych przeciwciałem anty-CD41-FITC. Fragmenty płytek krwi monitorowano przez wyliczanie fluorescencyjnych cząstek w bramkach ustalonych w celu wykrycia mniejszych cząstek. A, n = 4; B, n = 4; C, n = 3; D, n = 6. indukowana przez Ab aktywacja funkcjonalna szlaku oksydazy NADPH. Płytki krwi inkubowano z Ab oczyszczonym od osób kontrolnych lub od pacjentów z HIV-1-ITP. Ab pacjent, ale nie kontrolował, indukował aktywację (fosforylację) substratu kinazy P13 (AKT) 2,5-krotnie po 30 minutach (Figura 3A, densytometrię w porównaniu z kontrolą wewnętrzną). Opóźnienie to jest zgodne z okresem opóźnienia uzyskanym przed fragmentacją płytek krwi. Podobną aktywację ERK odnotowano również odpowiednio 2,1- i 2,3-krotnie po 15 i 30 minutach (Figura 3B). Figura 3C przedstawia indukowaną przez Ab translokację p47phox, p67phox i cPLA2 do błony, jak zauważono przy aktywacji granulocytów oksydazy NADPH. Figura 3Funkcjonalne dowody na aktywność oksydazy NADPH. Ludzkie płytki z filtrem żelowym inkubowano z 25 .g / ml kontroli lub pacjenta Ab w 37 ° C, ekstrahowano i poddano analizie immunoblotowej. (A) Wpływ Ab na aktywację AKT. C5, C15, C30 i P5, P15 i P30 odnoszą się odpowiednio do minut inkubacji z kontrolą lub pacjentem (P) Ab. LK-4 dotyczy inkubacji z nieistotnym mAb anty-GPIIIa. Aktyna jest kontrolą wewnętrzną (reprezentującą pięć eksperymentów). AKT-P, fosforylowane AKT. (B) Wpływ ab pacjenta na aktywację ERK-1/2. Górne ścieżki odnoszą się do reaktywności z Ab skierowanym przeciw fosforylowanej ERK (ERK-P). Dolne ścieżki odnoszą się do Ab skierowanego przeciwko białku kontrolnemu kontroli wewnętrznej (reprezentatywnemu dla trzech eksperymentów). (C) Wpływ Ab na translokację p67phox, p47phox i PLA2 z cytosolu do błony komórkowej. Płytki krwi inkubowano z Ab przez 30 minut w temperaturze 37 ° C, ekstrahowano, rozdzielono na cytozol i składniki błonowe, a następnie poddano immunoblottingowi specyficznymi Ab. M, marker dla p67phox i p47phox Ab. Plt odnosi się do płytek krwi w buforze, przed inkubacją. Cc, Cm i Pc, Pm odnoszą się do kontroli i AB pacjenta skierowanego przeciw cytozolom i frakcjom błony, odpowiednio. (D) Wpływ 12 (S) -HETE (200 nM) na translokację p67phox i p47phox z cytosolu w płytkach do frakcji błonowych. Hm, Hc, Cm i Cc odnoszą się odpowiednio do frakcji cytoplazmatycznej i błony z 12 (S) -HETE i inkubacji kontrolnych. PHm i PHc odnoszą się do inkubacji z 12 (S) -HETE i inhibitorem kinazy białkowej C, bisindolylomaleimidu przy 20 nM. Przedstawiciel trzech eksperymentów. Rola lipooksygenazy płytkowej w indukowanej przez Ab fragmentacji płytek krwi. Ponieważ wykazano, że produkt lipooksygenazy LTB4 indukuje ROS w komórkach niefagocytujących, zdecydowaliśmy się zbadać produkty lipooksygenazy płytkowej pod kątem możliwej roli w indukowanej przez Ab fragmentacji płytek krwi. Płytki krwi mają unikalną izoformę 12-LO o wyraźnej strukturze i kinetyce z enzymu znajdującego się w granulocytach. Przetestowaliśmy zdolność kilku różnych inhibitorów płytek krwi 12-LO do blokowania indukowanej przez Ab fragmentacji płytek krwi. Dane dotyczące odpowiedzi na dawkę dla hamowania przez kwas 5,8,11-eikozatriynoinowy (ETI), kwas nordihydroguia-retretowy (NDGA) i selektywny inhibitor 12-LO, 3,4-dihydroksy-a-cyjanoocynamonian cynamylowy (CDC) są przedstawione na rysunku 4A. Stwierdzono, że każde z nich ma IC50 odpowiednie do hamowania 12-LO (ETI, 20 (M, NDGA, 40 (M, CDC, 200 nM). Dane te silnie sugerują, że zarówno płytkowa 12-LO, jak i oksydaza NADPH, były wymagane do indukowanej przez Ab fragmentacji płytek krwi. Figura 4Ról płytki 12-LO w indukowanej anty-GPIIIa49a66y fragmentacji płytek krwi. (A) Inhibitory lipooksygenazy: kwas 5-, 8-, 11-eikozatriynoinowy (ETI), kwas nordihydrogenowy (NDGA) (n = 4) i 3-dihydrocyjanocynamonian cynamylowy (CDC) (n = 8) do filtrowanych na żelu ludzkich płytek krwi 15 minut przed Ab, a procent pomiarów fragmentacji wykonano po 4-godzinnej inkubacji. Cg, kontrola IgG (25 ug / ml); Ci, kontrola IgG plus inhibitor (25 .g / ml); 0, pacjent IgG bez inhibitora (25 .g / ml). (B) Wpływ produktów 12-LO, 12 (S) -HETE i 12 (S) -HPETE (n = 8), na fragmentację płytek krwi. 12 (R) -HETE jest stereoziomerem pochodzącym z niezwiązków lipidowych (n = 3). (C) Porównanie indukowanej 12 (S) -HETEa fragmentacji płytek krwi (typowej dla trzech eksperymentów). (D) Wpływ pacjenta IgG (.g) vs. kontrolne IgG (Cg) na produkcję płytek krwi 12 (S) -HETE (typowe dla trzech eksperymentów). Bezpośredni wpływ produktów 12-LO na fragmentację płytek krwi został następnie przetestowany w dwóch różnych warunkach eksperymentalnych. Po pierwsze, płytki wystawiono na działanie różnych stężeń 12 (S) -HPETE i 12 (S) -HETE, jego stabilnego produktu rozpadu i oceniano poziom fragmentacji płytek krwi.
[hasła pokrewne: fazy choroby alkoholowej, niedoczynność tarczycy objawy skórne, osobowość paranoiczna test ]
[więcej w: zapalenie stawów u dziecka, dieta wątrobowa lekkostrawna, królik miniaturka baranek ]