Niezależna od dopełniacza indukowana przez Ab indukcja płytek krwi przez nadtlenek wymaga 12-lipooksygenazy i szlaku oksydazy płytkowej NADPH ad

Związek pomiędzy LTB4 i oksydazą NADPH jest nieznany. Tutaj (a) pokazujemy, że płytki mają funkcjonalny szlak oksydazy NADPH; (b) wskazują, że szlak jest aktywowany przez zakłócenie błonowe GPIIIa49a 66; i (c) opisują nową drogę ROS, w której 12 (S) -HETE, produkt 12-lipooksygenazy płytkowej (12-LO), aktywuje oksydazę NADPH po ligacji GPIIIa49 . 66. Tak więc, niezależna od dopełniacza indukowana przez Ab fragmentacja płytek krwi poprzez wytwarzanie oksydazy NADPH z ROS wymaga aktywacji płytki 12-LO. Wyniki Brak granulocytów w preparatach płytek krwi filtrowanych żelem. Figura 1A demonstruje brak granulocytów / monocytów w preparacie płytek krwi przefiltrowanym przez żel, jak zbadano za pomocą cytometrii przepływowej ze specyficznym dla granulocytów / makrofagów anty-CD11b Ab. Można wykazać, że więcej niż 99% płytek krwi było wolnych od reaktywności CDllb. Potwierdziło to badanie mikroskopii fazowej 2000 płytek krwi, w których nie uwidoczniono leukocytów. W związku z tym wykluczono kontaminację płytek krwi granulocytami / monocytami lub krzyżową wymianę między obydwoma komórkami. Figura Obecność granulocytów i obecność składnika oksydazy NADPH gp91phox w płytkach filtrowanych żelem. (A) Porównanie fluorescencji z cytometrią przepływową preparatu leukocytarno-płytkowego z płytkami filtrowanymi żelem. Dolny lewy panel: przedni punktowy wykres punktowy scatter wzbogaconego preparatu leukocytarno-płytkowego. G, granulocyty; L, limfocyty; Pl, płytki krwi, jak wskazano ich znanym wzorcem rozproszenia. Górny lewy panel: podobny wykres płytek z filtrem żelowym. Dolny prawy panel: antyA CD11b-FITC Reaktywność ab specyficzna dla granulocytów / monocytów. Górny prawy panel: podobny wykres płytek z filtrem żelowym. Granulocytocytalne przeciwciało anty-CD11b-FITC było niereaktywne z płytkami z filtrem żelowym (<0,1%). FSH, wysokość rozproszenia do przodu; SSH, wysokość rozproszenia bocznego. (B) Reaktywność anty-Gp91 Ab z granulocytami i płytkami krwi. Górne panele: kontrolne mysie mAb, reaktywność z płytkami krwi i granulocytami. Niższe panele: monoklonalna fluorescencja anty-Gp91. Obecność aktywnej oksydazy NADPH w mysich płytkach krwi i gp91phox w ludzkich płytkach krwi. Chociaż nasze poprzednie badania wykazały, że ROS są niezbędne do fragmentacji płytek krwi za pośrednictwem Ab, źródło ROS nie zostało zdefiniowane. W naszym poprzednim raporcie wykazaliśmy nieobecność / upośledzenie indukowanej anty-GPIIIa49P6: 3 fragmentacji płytek krwi / trombocytopenii in vivo z mysim niedoborem NADPH, oksydazą p47phoxa /. myszy, ale nie badał wpływu Ab na fragmentację płytek krwi in vitro. Dlatego nie wykluczono działania ogólnoustrojowego lub efektu granulocytów / makrofagów. W związku z tym inkubowaliśmy inny preparat płytek krwi z niedoborem oksydazy NADPH z gp91phox. /. myszy z przeciwpłytkowym Ab. Gp91phox. /. płytki krwi nie uległy fragmentacji płytek krwi in vitro po wystawieniu na działanie przeciwciała anty. GPIIIa49. 66 (procentowe fragmentowanie w kontroli, 6,4%. 0,06%, w porównaniu z IgG pacjenta, 5,9%. 0,06%), podczas gdy płytki myszy WT ulegały fragmentacji (fragmentacja procentowa). pod kontrolą, 5,7%. 0,06%, w porównaniu do IgG pacjenta, 31,8%. 5,4%), wykluczając efekt ogólnoustrojowy. Obecność błony gp91phox wykazano również w ludzkich przesączonych żelem płytkach za pomocą cytometrii przepływowej ze specyficznym mAb przeciw gp91phox (Figura 1B). Płytki krwi miały znaczną reaktywność, która była podobna do obserwowanej w granulocytach. Klasyczne inhibitory szlaku oksydazy NADPH hamują indukowaną przez Ab fragmentację płytek krwi in vitro. Aby określić, czy płytki krwi mają funkcjonujący szlak oksydazy NADPH reagujący na zaburzenia perturbacji, zastosowaliśmy klasyczne inhibitory systemu, aby określić, czy będą hamować indukowaną przez Ab fragmentację płytek krwi. PTX, inhibitor receptorów sprzężonych z białkiem G, hamował in vitro fragmentację płytek przy 5 ng / ml (fragmentacja 28% w nietraktowanym porównaniu 5,5% po PTX i 6% po leczeniu kontrolnym, reprezentująca dwa podobne eksperymenty). Podobne wyniki otrzymano dla innych inhibitorów (Figura 2), o których wiadomo, że zakłócają ten szlak. Wartości IC50 dla hamowania kilku kluczowych enzymów oszacowano jako kinazę PI3 z LY294002 przy 10. M, kinazę białkową C z bisindoliloimaleimidem przy 20 nM, p38 MAPK z SB203290 przy 5. M i PLA2 z bromkiem bromofenacylu przy 50. M. Figura 2 Hamowanie indukowanej przez Ab fragmentacji płytek krwi klasycznymi inhibitorami szlaku oksydazy NADPH. Ludzkie płytki z filtrem żelowym wstępnie inkubowano z inhibitorami w różnych stężeniach przez 15 minut przed dodaniem oczyszczonego przez powinowactwo przeciwciała anty-GPIIIa49 . 66 (AP) lub kontrolnego (C) IgG o stężeniu 25 ug / ml przez 4 godziny. Ci, kontrola IgG plus inhibitor; BPB, bromek bomofenacylu [więcej w: gops jabłonna, kolonoskopia przygotowanie do badania, pierwsze posiłki niemowlaka ] [patrz też: fazy choroby alkoholowej, przepuklina brzuszna pooperacyjna, miód nawłociowy właściwości lecznicze ]