Niezależna od dopełniacza indukowana przez Ab indukcja płytek krwi przez nadtlenek wymaga 12-lipooksygenazy i szlaku oksydazy płytkowej NADPH ad 8

Supernatant odwirowano następnie przy 30 000 g przez godzinę i osad membranowy ponownie zawieszono w początkowej zawiesinie 0,34 M buforu relaksacyjnego sacharozy / pół-siły zawierającego mM DTT. Cytosol i membrany przechowywano w temperaturze około 70 ° C. P47phox, p67phox i cPLA2 były następnie testowane za pomocą analizy immunoblotów ze specyficznym Ab, a następnie odpowiednim drugorzędowym Ab połączonym z HRP (Santa Cruz Biotechnology Inc.). Bloty zostały opracowane przez chemiluminescencję. Pomiar markera cytosolowego, dehydrogenazy mlekowej, ujawnił, że frakcje błonowe zawierały minimalne pułapkowanie całkowitej LDH (9,5%. 1,4%, n = 8) przy braku istotnej zmienności przed lub po translokacji. Test produkcji 12-HETE płytek krwi. Płytki oczyszczone na żelu (108/100 (I) inkubowano z kontrolą lub pacjentem Ab, jak opisano powyżej. Interakcję zatrzymano przez dodanie objętości lodowatego acetonu (uzyskując całkowitą objętość 200 .l) i próbki utrzymywano w temperaturze ~ 70 ° C aż do ekstrakcji. Lipidy ekstrahowano do eteru i analizowano za pomocą HPLC w układzie faz odwróconych, jak opisano wcześniej (65). 12-HETE oceniono ilościowo za pomocą absorbancji UV przy 237 nm. Oznaczanie liczby płytek krwi myszy. Dwadzieścia mikrolitrów krwi pobrano z zatoki oczodołowej do unopettes (5854, systemy immunocytometryczne Becton Dickinson) o optymalnym stężeniu antykoagulacyjnym i rozcieńczalniku do liczenia płytek krwi za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. Podziękowania Praca ta została wsparta grantami NIH HL-13336 i DA-04315 (dla S. Karpatkin) oraz The Dorothy and Seymour Weinstein Research Fund. Autorzy dziękują Yelenie Gor za pomoc w testach 12-HETE. Footnotes Praca ta została zaprezentowana podczas corocznego spotkania American Society of Hematology w Filadelfii, Pensylwania, USA, 9 grudnia 2002 r. Fragmenty tej pracy pojawiły się w formie abstrakcyjnej (2002. Blood 100: 52A). Zastosowano niestandardowe skróty: małopłytkowość autoimmunologiczna (AITP); cynamono-3,4-dihydroksy-a-cyjanocynamonian (CDC); krążące kompleksy immunologiczne (CIC); cytozolowa fosfolipaza A2 (cPLA2); Dioctan DCFH (DCFH-DA); dichlorodihydrofluoresceina (DCFH); jod difenylenowy (DPI); Kwas 5,8,11-eikozatriynoinowy (ETI); pozakomórkowa kinaza regulowana sygnałem (ERK); flawinowy dinukleotyd adeninowy (FAD); małopłytkowość immunologiczna (HIV-1-ITP); leukotrien B4 (LTB4); 12-lipooksygenaza (12-LO); kwas nordihydroguiaretowy (NDGA); Substrat kinazy P13 (AKT); p38 mitogenna aktywowana kinaza białkowa (p38 MAPK); toksyna krztuśca (PTX); fagocytowa oksydaza (phox); reaktywne formy tlenu (ROS). Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów.
[hasła pokrewne: powiększanie biustu tłuszczem, rozwój psychomotoryczny dziecka, gops jabłonna ]
[podobne: szczoteczka soniczna oral b, przychodnia jabłonna, pierwsze posiłki niemowlaka ]