Hamowanie przeżycia komórek śródbłonka i angiogenezy przez kinazę białkową A. ad 6

Punkty rozgałęzienia naczyń krwionośnych oznaczono ilościowo po 48 godzinach. Rozszczepianie kaspazy-3 i -8 oceniono przez Western blotting z (b) anty-ciętymi kaspazą-3 lub (d) anty-odciętymi kaspazą-8 Abs i anty-aktyną Ab. (e) Cryozyfikacje CAM traktowanych jak w A (D zostały wybarwione immunologicznie dla ekspresji vWF (czerwone) i dla wykrycia fragmentacji DNA (barwienie TUNEL, zielone). Strzałki wskazują naczynia krwionośne. Naczynia apoptyczne są żółte. Nieligowane integryny indukują zależną od PKA apoptozę. Ligacja integryny aktywuje szlaki sygnałowe, które promują migrację komórek, proliferację i przeżycie. Zazwyczaj sygnalizacja za pośrednictwem integryny charakteryzuje się wzrostem fosforylacji tyrozyny pośredników sygnałowych, takich jak ogniskowa kinaza adhezji, src i członkowie rodziny ERK. Jednak ligacja integryny hamuje także aktywację co najmniej jednej kinazy, PKA (19). Co ważne, stwierdziliśmy, że podwiązanie integryny hamuje aktywację PKA, podczas gdy antagoniści integryn aktywują ten enzym (Figura 6a). Warto zauważyć, że antagoniści integryny a (3l aktywują komórki śródbłonka PKA, czy komórki śródbłonka są umieszczane na fibronektynie lub na witronektynie (Figura 6a). Dlatego badaliśmy udział PKA w śmierci komórkowej za pośrednictwem integryny. Stwierdziliśmy, że inhibitor farmakologiczny PKA, HA1004, zasadniczo tłumił apoptozę indukowaną przez antagonistów integryny anty-avp3 (P = 0,05) lub anty-A ^ (1 (P = 0,05) w komórkach przyłączonych do witronektyny, jak wykryto. przez aneksynę V wiążącą się z nienaruszonymi komórkami (Figura 6b). Inhibitory PKA blokowały również cięcie kaspazą-3 indukowane przez anty-A ^ J (P = 0,002, Figura 6c). Ekspresja dnPKA, ale nie kontrolnego transgenu (GFP), również zapobiegła indukowanej przez antagonistę integryny integrynie komórkowej śmierci komórki (P = 0,004; Figura 7, aib). Ponad 80% komórek eksprymowało transgen, który również wykryto metodą Western blot (Figura 7d). Badania te wskazują, że zarówno bezpośrednia (anoikis), jak i mediowana pośrednio zależność od integryny integryny, jest zależna od PKA. Figura 6 Niezwiązana śmierć, w której pośredniczy 5. 1, jest zależna od PKA. (a) Aktywność PKA mierzono w komórkach HUVEC przyłączonych do poli-L-lizyny, fibronektyny lub witronektyny w obecności lub nieobecności antagonistów integryny. (b) HUVEC wysiano na powleczone witronektyną lub powleczone poli-L-lizyną płytki do hodowli w obecności lub nieobecności przeciwciał anty-a5 ^ lub anty-av3As, selektywny inhibitor PKA (1. M HA1004) lub anty-integrynę Ab. S w połączeniu z 1. M HA1004. Po 24 godzinach określono procent komórek pozytywnych pod względem aneksyny FITC. (c) Lizaty komórkowe z b poddano immunoblottingu z użyciem anty-kaspazy-3 i anty-ciętych Abps kaspazy-3. Względne cięcie kaspazą-3 określono przez densytometrię. Figura 7PKA negatywnie reguluje przeżycie komórek. (aib) HUVEC transfekowane GFP (y) lub dnPKA (+) były powlekane na (a) pokrytych fibronektyną, (b) powlekanych witronektyną lub płytkach powleczonych poli-L-lizyną. pod nieobecność lub obecność anty-A 5. p 1, anty-p> P3 lub anty-p 2 P 1. Po 24 godzinach określono procent komórek V aneksyny aneksyny. (c) HUVEC potraktowane pożywką hodowlaną lub dibutyrylo cAMP (250 .M) i HUVEC transfekowane GFP lub katalityczną podjednostką PKA (PKAcat) wysiano na płytkach powleczonych witronektyną lub poli-L-lizyną. Po 24 godzinach określono procent komórek V aneksyny aneksyny. (d) Ekspresję transgenów wykrywano przez lizaty komórek typu Western blot z anty-GFP lub anty-V5. Aktywacja PKA indukuje apoptozę komórek śródbłonka in vitro i in vivo. Nasze badania pokazują, że hamowanie PKA tłumi indukowaną przez antagonistę integryny integrynę śmierć komórki. Aby określić, czy aktywacja PKA bezpośrednio indukuje śmierć komórek śródbłonka, komórki śródbłonka leczono dibutyrylo-cAMP lub przejściowo transfekowano aktywną, katalityczną podjednostką PKA. Zarówno cAMP, jak i ekspresja katalitycznej podjednostki PKA istotnie indukują apoptozę (odpowiednio P = 0,009 i P = 0,003) w komórkach śródbłonka in vitro (Figura 7c). Zatem PKA bezpośrednio indukuje apoptozę w komórkach śródbłonka. W celu ustalenia, czy PKA odgrywa rolę w negatywnej regulacji angiogenezy in vivo, stymulowane bFGF CAM transfekowano plazmidami ekspresyjnymi kodującymi GFP i dnPKA i traktowano Ab (5Ai. Podczas gdy antagoniści. 5. blokują angiogenezę (Figura 8a, P = 0,004), dnPKA odwraca to hamowanie (Figura 8a, P = 0,02). Ekspresja dnPKA zapobiega również fragmentacji DNA indukowanej przez a5 ^ indukowanej przez DNA in vivo, co wykrywa się przez barwienie TUNEL (Figura 8b) i hamuje aktywację kaspazy-3 i -8 in vivo (Figura 8c)
[podobne: przepuklina brzuszna pooperacyjna, jakie spodnie do biegania, lekarz chorób wewnętrznych ]
[przypisy: fazy choroby alkoholowej, przepuklina brzuszna pooperacyjna, miód nawłociowy właściwości lecznicze ]