Brak sygnalizacji receptora prolaktyny u myszy powoduje proliferację laktotropową i prolactinoma przez mechanizmy zależne i zależne od dopaminy ad

Test radioimmunologiczny PRL wykorzystał preparat referencyjny myszy PRL (mPRL) AFP6476C, mPRL AFP1077D do jodowania i surowicę odpornościową anty-mPRL AFP131078 (dostarczone przez AF Parlow i National Hormone and Peptide Program, Harbor. UCLA Medical Center, Torrance, Kalifornia, USA). Test przeprowadzono zgodnie z zaleceniami, z tym wyjątkiem, że mPRL był jodowany 3 .g chloraminy-T (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) na peptyd i oczyszczony przez kulki z żywicy Dowex 20-50 chlorków (Bio- Rad Laboratories Inc., Hercules, Kalifornia, USA); około 20 000 cpm dodano do każdej probówki. Czułość testu wynosiła 15 ng / ml przy użyciu 10-la próbek surowicy. Próbki analizowano w dwóch powtórzeniach w wielu rozcieńczeniach. W przypadku odpowiedzi na lek, podstawową surowicę pobrano od 15-miesięcznych samców myszy, następnie 5 mg / kg 2-bromo-a-ergokryptyny (bromokryptyna, Sigma-Aldrich) lub 10 mg / kg haloperidolu (Ortho-McNeil Pharmaceutical, Raritan, New Jersey, USA) podawano dootrzewnowo, a próbki surowicy po traktowaniu uzyskano godzinę później. Analizy histologiczne. Myszy uśmiercono przez dekapitację w wieku 6, 12, 14 lub 18. 21 miesięcy, i ich przysadki przysadkowe zbadano wizualnie za pomocą mikroskopu sekcyjnego, zważono i umieszczono natychmiast w 10% zbuforowanej formalinie. Skrawki zatopione w parafinie o grubości 4 – 5 .m zostały wybarwione hematoksyliną i eozyną lub metodą Gordona-Sweet silver dla matrycy retikuliny. Barwienie immunohistochemiczne w celu identyfikacji hormonów adenohypophyseal przeprowadzono przy użyciu techniki peroksydazy streptawidyna-biotyna. Pierwotną surowicę odpornościową skierowaną przeciwko hormonom przysadki szczura zastosowano w następujących rozcieńczeniach: hormon wzrostu (GH), 1: 2500; PRL, 1: 2,500; hormon pobudzający tarczycę (TSH-a), 1: 3 000; hormon folikulotropowy. (FSH-a), 1: 600; hormon luteinizujący (LH-a), 1: 2500 (wszystkie dostarczone przez AF Parlow i Narodowy Program Hormonów i Peptydów); i wstępnie rozcieńczony hormon adrenokortykotropowy (ACTH), dalej rozcieńczony 1:20 (DAKO Corp., Carpinteria, California, USA). Ocena podwzgórzowej funkcji neuronów dopaminergicznych. Ekspresję genu TH oceniano przez hybrydyzację in situ. Myszy uśmiercono przez dekapitację, a mózgi usunięto i szybko zamrożono w izopentanie nad suchym lodem i przechowywano w temperaturze <80 ° C. Dziesięć mikrometrów wycięto na kriostacie i rozmrożono na szkiełkach powlekanych żelatyną. MRNA TH wykryto przez hybrydyzację w temperaturze 60 ° C z 20 milionami cpm / ml antysensownej ribosfery znakowanej 35S-UTPy (dostarczonej przez E. Lewis, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Oregon Health & Science University, Portland, Oregon, USA ). Preparaty eksponowano na emulsję NBT2 (Eastman Kodak, Rochester, New York, USA) przez 15 dni, wywoływano i barwiono kontrastowo neutralną czerwienią. Obrazy cyfrowe przechwytywano przy użyciu zarówno jasnego jak i ciemnego pola oświetleniowego w mikroskopie badawczym Leica (Leica Microsystems Inc., Deerfield, Illinois, USA). Aktywność TH oszacowano przez pomiar akumulacji 3,4-dihydroksyfenyloalaniny (DOPA) po zahamowaniu dekarboksylazy aromatycznego aminokwasu (AADC) przez dichlorowodorek m-hydroksybenzylohydrazyny (NSD 1015, Sigma-Aldrich). Pokrótce, myszy uśmiercono przez dekapitację 30 minut po iniekcji dootrzewnowej 100 mg / kg NSD 1015. Całe blokowane podwzgórze i część grzbietowej prążkowia zamrożono szybko w izopentanie na suchym lodzie i przechowywano w temperaturze <80 ° C do czasu analizy. Podwzgórze sonifikowano w 20 objętościach i poddawano działaniu prążków w 50 objętościach roztworu homogenizacyjnego i poddawano HPLC i elektrochemicznej detekcji DOPA, jak opisano wcześniej (33). Pierwotne kultury przednich komórek przysadki mózgowej. Przednie przysadki mózgowe zebrano od losowo obiegowych myszy C57BL / 6J i umieszczono w lodowatym HBSS (Sigma-Aldrich) i zdysocjowano enzymatycznie w HBSS zawierającym kolagenazę, dezoksyrybonukleazę i BSA jak opisano wcześniej (34). Komórki wysiewano na 250 000 komórek / studzienkę na szkiełkach nakrywkowych powleczonych poli-L-lizyną. W 24-studzienkowych płytkach w pożywce DMEM / Ham F12 (1: 1, Sigma-Aldrich) zawierającej 50 U / ml penicyliny G, 50. g / ml streptomycyny i 10% FBS przez 24 godziny. Następnego dnia, 24 godziny przed traktowaniem PRL, pożywkę zastąpiono DMEM / F12 uzupełnionym Serum Replacement 2 (Sigma-Aldrich). W przypadku 48-godzinnego traktowania PRL pożywkę zastąpiono DMEM / F12 / Replace Serum 2 zawierającą zrekombinowane mPRL (0. 10. G / ml, dostarczone przez AF Parlow i National Hormone and Peptide Program). Pożywki i leczenie zmieniono po 24 godzinach, i dodano 0,1 mM bromodeoksyurydyny (BrdU, Sigma-Aldrich) w ciągu ostatnich 12 godzin traktowania PRL. Proliferacja komórek laktotropowych. Proliferację komórek laktotropowych określono przez identyfikację komórek wykazujących immunoreaktywność zarówno dla BrdU jak i PRL [podobne: lekarz chorób wewnętrznych, zapalenie migdałków jak leczyć, pierwsze posiłki niemowlaka ] [podobne: niedoczynność tarczycy objawy skórne, sok z czarnego bzu przepis, zapalenie migdałków jak leczyć ]