Blokada dehydrogenazy 11 (3-hydroksysteroidowej zapobiega strukturalnej strukturze skóry i wadom funkcji wywołanym przez wiek ad 7

Oprogramowanie do analizy obrazu Nuance zostało użyte do opisu interfejsu DEJ i warstwy rogowej naskórka (CRI, Advanced Molecular Vision). Intensywność barwienia mierzono w naskórku i górnej skórze właściwej. Histologia Tkanka była przechowywana w 10% obojętnej buforowanej formalinie (4 g monofosforanu sodu, 6,5 g difosforanu sodu w 900 ml wody destylowanej i 100 ml 37% formaldehydu) przed zatopieniem w parafinie i pocięciu na kawałki. Połączone sekcje z każdego wieku i genotypu zostały wycięte na szkiełko. Po odparafinowaniu i ponownym uwodnieniu (26), szkiełka barwiono H & E, zawieszano, przykrywano i analizowano w sposób zaślepiony przez 2 niezależnych badaczy. Skrawki wybarwiono kolagenem stosując zestaw trichromowy Masson zgodnie z wytycznymi producenta. Intensywność plamienia kolagenu określono za pomocą opisanego powyżej systemu Nuance. Ekstrakcja RNA i odwrotna transkrypcja Całkowity RNA ekstrahowano z pierwotnych hodowli HDF przy użyciu metody Tri-Reagent (Sigma-Aldrich), z wytwarzaniem cDNA przez odwrotną transkrypcję, jak opisano wcześniej (26). Tkankowe RNA ekstrahowano przy użyciu zestawu RNeasy Fibrous Tissue (QIAGEN) przy użyciu homogenizatora PowerGen 125 (Fisher Scientific) zgodnie z protokołem producenta. Analiza ekspresji genu PCR w czasie rzeczywistym Badania HDF. System BioMark (Fluidigm) został wykorzystany do analizy ekspresji 33 genów zaangażowanych w biosyntezę i przetwarzanie kolagenu. Konkretne docelowe przedamplifikowanie przeprowadzono w objętościach 5 .l składających się z 2,5 .l TaqMan PreAmp Master Mix (2 ×, Applied Biosystems), z testem ekspresji genu TaqMan z 1,25 .l (1 .l dla każdego testu i 4 .l). x bufor TE, 0,2 x końcowe stężenie oznaczenia) i 1,25 ul (25. 50 ng) cDNA (lub x TE dla kontroli ujemnej). Po krótkim wirowaniu i wirowaniu, próbki ogrzewano do 95 ° C przez 10 minut, a następnie 14 cykli w 95 ° C przez 15 sekund i 60 ° C przez 4 minuty. Próbki rozcieńczono następnie 1: 5 20 ul x buforu TE. Po wstępnej amplifikacji, .l każdej próbki również połączono i seryjnie rozcieńczono w buforze x TE (1:10, 1: 100, 1: 1000 i 1: 10 000) w celu wygenerowania standardowej krzywej. Próbki (w trzech powtórzeniach) i standardy (w dwóch powtórzeniach) przygotowano do załadowania na chip w objętościach 8 ul w 96-studzienkowej płytce: 4 ul TaqMan Universal PCR Master Mix (2 x); 0,4 .l odczynnika do pobierania próbek GE (20 ×, Fluidigm); i 3,6 jl wstępnie amplifikowanego cDNA na standard. Płytki wirowano, odwirowywano i przechowywano w temperaturze 5 ° C do momentu, gdy było to wymagane. Testy ekspresji genów przygotowano w objętości 8 ul w objętości: 4 ul testu ekspresji genu TaqMan (20 x) i 4 ul testowego odczynnika do pobierania (2 x, Fluidigm), uzyskując ostateczne stężenia 9. M i 2,5. M odpowiednio dla starterów i sondy na test. Próbki worteksowano, odwirowywano i przechowywano w 5 ° C. Chipsy zagruntowano za pomocą kontrolera IFC zgodnie z protokołem producenta (Fluidigm), załadowano 5 .l Sample Mix, 5 .l testu Assay Mix i aktywowano za pomocą kontrolera IFC. Chipsy poddano obróbce za pomocą ilościowego czytnika PCR BioMark (Fluidigm). Po standardowej weryfikacji krzywej, wyznaczono wartości Ct dla każdej próbki przez normalizację do średniej geometrycznej 4 genów gospodyni (RPL13, TBP, B2M i PPIA). Mysie tkanki: poziomy Leprel1, Plod1, Timp4, Col1a1, Mmp2 i Mmp3 mierzono (w dwóch powtórzeniach) konwencjonalną metodą PCR w czasie rzeczywistym, stosując system ABI 7500 (PerkinElmer). PCR przeprowadzono w reakcjach 10-P w 96-studzienkowych płytkach. Reakcje zawierały 5 ul 2 x TaqMan Universal PCR Mastermix, 0,5 ul testu (900 nM startera i 250 nM końcowego stężenia sondy), 3,5 ul wody destylowanej i 1. L cDNA (25. 50 ng). Reakcje standaryzowano u gospodyni 18S (wszystkie Applied Biosystems). Reakcje były następujące: 50 ° C przez 2 minuty, 95 ° C przez 10 minut, 40 cykli w 95 ° C przez 15 sekund i 60 ° C przez minutę. Badania nad gojeniem się ran Badania nad inhibitorami 11-HSD1. Badania inhibitorów przeprowadzono na 8-tygodniowych samcach myszy szwajcarskich (n = 5-12) przy użyciu RO151, o którym wiadomo, że selektywnie hamuje aktywność 11 (3-HSD1 in vivo (59), przy IC50 40 nM (<4 nM SE; n = 17) przeciwko mysiemu homologowi (określonemu w testach komórkowych przy użyciu adipocytów 3T3-L1, dane nie przedstawione). Jeden procent RO151 sformułowano w 9,1% hydroksypropylo-beta-cyklodekstrynie, 0,5% Tris i 0,45% chlorku sodu (pH 7,3) przed dodaniem 3% hydroksypropylometylocelulozy w temperaturze pokojowej z wytworzeniem przezroczystego żelu. Rany grzbietowe o pełnej grubości około 10 mm2 wytworzono przy znieczuleniu ketaminą-ksylazyną. Żel zawierający inhibitor 11 (3-HSD1 i nośnik naniesiono i pokryto OpSite Flexifix (Smith & Nephew) i taśmą Hypafix (BSN Medical). [patrz też: szczoteczka soniczna oral b, powiększanie biustu tłuszczem, rozwój psychomotoryczny dziecka ] [patrz też: lekarz chorób wewnętrznych, gops jabłonna, 23 114 jabłonna ]