Blokada dehydrogenazy 11 (3-hydroksysteroidowej zapobiega strukturalnej strukturze skóry i wadom funkcji wywołanym przez wiek ad 6

Wreszcie, nasze badania mogą mieć implikacje w kontekście powolnie gojących się ran występujących u chorych na cukrzycę lub cierpiących na przewlekły stres, gdzie ograniczenie miejscowego pokolenia GC może również poprawić gojenie. Metody Materiały zakupiono od Sigma-Aldrich, o ile nie zaznaczono inaczej. Przygotowanie tkanki i hodowla komórkowa Tkanka ludzka. Grupa 40 zdrowych Caucasians składająca się z 20 młodych (rok. SD, 25,7. 3,0, 9 kobiet i 11 mężczyzn) i 20 starszych (72,2. 8,2, 11 kobiet i 9 mężczyzn) dawców przeszła 3-mm biopsję PE (dolna zewnętrzna ) i PP (wewnętrzna górna) ręka ramienia. Skórę sterylizowano i przykrywano preparatem Supadrape (Westfield Medical Ltd.) zawierającym środkową szczelinę przed miejscowym wstrzyknięciem znieczulenia za pomocą 2 ml 2% lidokainy HCl (National Veterinary Services). Po zdyspergowaniu skórę badano na drętwienie przed uzyskaniem 2 biopsji na miejsce z użyciem Stiefel 3-mm Biopsy Punch (Medisave). Gaza bawełniana była używana do powstrzymywania krwawienia przed plastrem Inadine i aplikacją Mepore (Oncall Medical Supplies). Tkankę przechowywano w kompletnych pożywkach (RPMI-1640, 10% FCS, 2 mM L-glutamina, 1% Pen-Strep, 1% pirogronian sodu i 1% aminokwasów niestanowiących znaczenia) i albo analizowano natychmiast albo zamrażano i przechowywano w -80 ° C. Tkanka myszy. Badania przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem (26). Skórka myszy od samców młodych (w wieku 11. 20 tygodni, n = 10) i w wieku (91. 99 tygodni, n = 5) myszy WT i od miotów z miotu o globalnej delecji 11 (3-HSD1 (wytwarzanego w domu; n = 15) (58) uzyskano przez rozcięcie ogolonej skóry z dolnego rejonu grzbietowego. Myszy 11-HSD1 KO krzyżowano wstecznie (więcej niż 9 pokoleń) myszom C57BL6 / J, stosując odpowiednie kontrole szczepów. Kultura HDF i leczenie. HDF hodowano z biopsji dolnej części zewnętrznej od kaukaskich dawców o różnym wieku przez inkubację przez 8 dni w 37 ° C w atmosferze 5% CO2 w kolbach T25 zawierających 2 ml kompletnych pożywek. Po osiągnięciu 80% konfluencji, komórki były pasażowane w stosunku 1: 3 w razie potrzeby. W celu obróbki GC komórki wysiano na 6-studzienkowe płytki z konfluencją 70% i inkubowano przez noc. Komórki traktowano 100 nM kortyzolu (w dwóch powtórzeniach) przez 48 godzin i porównywano z kontrolnymi traktowanymi podłożem. Testy aktywności 11-HSD1 Jedna biopsja na miejsce na dawcę ludzkiego (~ 4. 10 mg) była analizowana pod kątem aktywności 11. -HSD1 (oksydoreduktazy). Eksplanty skóry myszy (~ 6 mg) analizowano w dwóch powtórzeniach. Nienaruszona aktywność tkankowa była mierzona w 10-ml szklanych probówkach zawierających 0,5 ml kompletnych pożywek, 100 pmol kortyzonu lub 11-dehydrokortykosteronu odpowiednio dla skóry ludzkiej i myszy, oraz ilości znaczników [3H] kortyzonu lub 11-dehydrokortykosteronu, jak wcześniej podano ( 26). W przypadku ludzkiej tkanki aktywność wyrażono jako procent konwersji kortyzonu w kortyzol (24 godziny). W tych próbkach aktywność nie była znormalizowana w odniesieniu do masy tkanki. który był zwiększony w próbkach PE (Supplemental Figure 1A, materiał uzupełniający dostępny online w tym artykule, doi: 10.1172 / JCI64162DS1), dzięki głębszej warstwie skórnej składającej się głównie z obojętnych białek strukturalnych, np. kolagenu. ponieważ nie korelowało to z aktywnością enzymu w żadnej z grup (Dodatkowa Figura 1B). Ponadto biopsje z wybijakiem standaryzowały tę samą powierzchnię między próbkami. W przypadku próbek myszy, aktywność enzymu znormalizowano pod względem masy tkanki (pmol kortykosteron / mg tkanki / h) w miarę zmiany powierzchni. Wykrywanie immunohistochemiczne 11H-HSD1 w zamrożonych skrawkach ludzkiej skóry (utrwalonych w acetonie / etanolu 3: 1) analizowano za pomocą immunohistochemii przy użyciu pierwotnego mAb (Abcam) i skoniugowanego z alkaliczną fosfatazą kozich anty-mysich drugorzędowych Ab (Dako). Tabletki Fast Red TR / Naphthol AS-MX zostały użyte do wizualizacji wybarwienia zgodnie z wytycznymi producenta. W skrócie, szkiełka inkubowano przez 15 minut w 56: metanolu / nadtlenku wodoru dla inaktywacji endogennych peroksydaz, przepłukano dejonizowaną wodą i blokowano przez godzinę w TBSAT (10 ml 10 x TBS [121,2 g Tris / 160,4 g chlorku sodu, pH 7,6, w 2 litrach wody dejonizowanej], przechowywany w porcjach w temperaturze -20 ° C), 3 g BSA, 50 ul Tritonu X100 i 10% surowicy koziej. Skrawki odsączono i inkubowano przez 2 godziny w świeżym TBSAT z pierwotnym Ab rozcieńczonym 1: 100 przed płukaniem z mieszaniem w trzech 10-minutowych płukaniach TBST (~ 800 ml x TBS plus 0,05% Tween-20). Skrawki odsączono i inkubowano przez 30 minut w świeżym TBSAT z wtórnym Ab rozcieńczonym 1: 200 przed powtarzanymi przemywaniami. Po wizualizacji szkiełka suszono na powietrzu przed naniesieniem wodnego medium montażowego i szkiełek nakrywkowych. Barwienie obserwowano w podobnych strukturach do wcześniej opisanych za pomocą poliklonalnego Ab (26) i było ono pomijalne, gdy podstawiał równomolowe stężenia kontroli izotypowej (mysie IgM, AbCam) w pierwszorzędowym Ab (Suplementowa Figura 2). Skrawki sfotografowano przy użyciu systemu do obrazowania wielospektralnego Nuance (CRi, Advanced Molecular Vision)
[patrz też: zapalenie gardła u dzieci, przepuklina brzuszna pooperacyjna, jakie spodnie do biegania ]
[więcej w: zapalenie migdałków jak leczyć, oszczędzanie dla dziecka, osobowość paranoiczna test ]