Antagonista receptora chemokin CCR-1 zmniejsza zwłóknienie nerek po jednostronnej podwiązaniu moczowodu cd

Izolacja komórek nerkowych do analizy FACS. Preparat izolowanych komórek nerkowych, w tym naciekających leukocyty, uzyskano z zatkanych i przeciwstronnych nerek, jak opisano wcześniej (8). Otrzymane supernatanty i próbki krwi pobrane od znieczulonych myszy przez nakłucie pozagałkowe zostały następnie oznaczone jako cytometria przepływowa. Próbki inkubowano z 5 .g / ml mAbs przeciwko mysiej CCR2, mysiej CCR5 lub szczurzemu kontrolnemu szczurzemu IgG2b (PharMingen), jak opisano (17). Aby zidentyfikować podzbiory leukocytów, próbki inkubowano z następującymi sprzężonymi bezpośrednio swoistymi dla komórki Ab: s-izotiocyjanianem fluoresceiny CD11b (klon M1 / 70), allofikocyjaninami CD4 i CyChrome CD8 (wszystkie PharMingen). W każdej analizie zebrano około 100 000 bramkowanych zdarzeń. RT-PCR ilościowy w czasie rzeczywistym. Z każdego zwierzęcia próbki obu nerek zamrażano błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze ~ 80 ° C. Przygotowanie RNA i RT-PCR w czasie rzeczywistym w systemie do wykrywania sekwencji TaąMan ABI 7700 (PE Biosystems, Weiterstadt, Niemcy) przeprowadzono w opisany sposób (18). Kontrole składające się z ddH2O były negatywne dla celu i gospodyni, GAPDH. Zastosowano następujące startery oligonukleotydowe (300 nM) i sondy (100 nM): mysi kolagen I (1 (gb X 54876; bp 1984. 2102): sensowny, 5. -TGCTTTCTGCCCGGAAGA-3 ., antysensowny, 5. -GGGATGCCATCTCGTCCA- 3 (3, wewnętrzna sonda znakowana fluorescencyjnie (FAM), 5a-CCAGGGTCTCCCTTGGGTCCTACATCT-3; mysi GAPDH (gb M32599, bp 730 836): sensowny, 5. -CATGGCCTTCCGTGTTCCTA-3 ., antysensowny 5. -ATGCCTGCTTCACCACCTTCT-3 ., wewnętrzna znakowana fluorescencyjnie sonda (VIC), 5. -CCCAATGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3 .. Wszystkie sondy otrzymano z PE Biosystems. Western blot. Nerki homogenizowano w buforze RIPA (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Niemcy). Wyekstrahowane białka gotowano w buforze obciążającym przez 10 minut, rozdzielono przez 8% SDS-PAGE i przeniesiono na błonę Immobilon-P (Millipore, Eschborn, Niemcy). Po zablokowaniu, filtr inkubowano z króliczym poliklonalnym anty-kolagenem I Ab (1: 1000, Chemicon International, Temecula, California, USA), a kompleksy immunologiczne wizualizowano stosując sprzężone z peroksydazą Ab (1: 5000 w roztworze blokującym; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pennsylvania, USA), a następnie przetwarzane w celu wykrycia przez wzmocnioną chemiluminescencję (ECL, Amersham Pharmacia Biotech Europe, Freiburg, Niemcy). Analiza statystyczna. Dane wyrażono jako średnią plus lub minus SD. Porównanie grup przeprowadzono przy użyciu jednowariantowej ANOVA, a korelację post hoc Bonferroniego zastosowano do wielokrotnych porównań. Test t-Studenta w parach użyto do porównania pojedynczych grup (dane RT-PCR i FACS). Wartość AP mniejsza niż 0,05 została uznana za wskazującą na istotność statystyczną. Wyniki Wiązanie BX471 z mysim CCR1. Na początku określiliśmy powinowactwo BX471 do mysiego CCR1 w badaniach wiązania konkurencyjnego. W eksperymentach wiązania kompetycyjnego z komórkami HEK 293 eksprymującymi ludzką CCR1, BX471 był zdolny do przemieszczania wiązania 125I-MIP-1 (3 / CCL3 w sposób zależny od stężenia z KI wynoszącym 1,0. 0,03 nM, który jest podobny do KI dla MIP-1 A / CCL3 2 nM (14). Tutaj pokazujemy, że BX471 był również zdolny do przemieszczania wiązania 125I-MIP-1 (3 / CCL3 do mysiej CCR1 w sposób zależny od stężenia z KI wynoszącym 215. 46 nM (rysunek 1). Ponieważ było to około 20-krotnie niższe w porównaniu z wiązaniem z ludzkim CCR1, badaliśmy specyficzność BX471 wobec mysich CCR1 w porównaniu z innymi mysimi receptorami chemokin, o których wiadomo, że są zaangażowane w model UUO (8). BX471 nie reagował krzyżowo z CCR2, CCR5 i CXCR4 w stężeniach większych niż 50. M, co dawało co najmniej 250-krotność swoistości dla CCR1 (dane nie pokazane). Figura Związanie BX471 z mysim CCR1. Antagonista CCR1, BX471, zastępuje radioznakowany MIP-1. z mysiego CCR1. Komórki HEK transfekowane mysim CCR1 inkubowano z 125I-MIP-1- (3 / CCL3 w obecności rosnących stężeń BX471. Reakcje wiązania zakończono przez odwirowanie komórek jak opisano wcześniej (14). Pokazane wiązanie przedstawia specyficzne wiązanie z typowego eksperymentu (n = 3). Niespecyficzne wiązanie stanowiło 10% całkowitej ilości 125I-MIP-1 (3 / CCL3. Wstawka pokazuje wykres Scatcharda danych przemieszczenia. Cytosolic Ca2 + w komórkach HEK 293. Aby wykazać, że BX471 jest funkcjonalnym antagonistą mysiego CCR1, zmierzyliśmy zdolność związku do hamowania mobilizacji Ca2 + wywołanej przez agonistę w komórkach wyrażających CCR1. Jak pokazano na Figurze 2, MIP-y / CCL3 indukował szybki i przejściowy wzrost wewnątrzkomórkowego Ca2 + w ludzkim i mysim CCR1. Zwiększenie stężenia BX471 zahamowało transfery Ca2 + indukowane przez MIP-1 (3 / CCL3 w ludzkim i mysim CCR1 przy IC50 5,8. nM i 198. 7 nM, odpowiednio, wykazujące funkcjonalny antagonizm dla CCR1 (Figura 2)
[więcej w: dieta wątrobowa lekkostrawna, przepuklina brzuszna pooperacyjna, królik miniaturka baranek ]
[podobne: zapalenie migdałków jak leczyć, oszczędzanie dla dziecka, osobowość paranoiczna test ]